1. Di dalam piring kultur, rendam gelongsor yang telah dipanjat dengan PBS sebanyak tiga kali selama 3 minit setiap kali.
2. Betulkan slaid dengan 4 peratus paraformaldehid selama 15 minit, dan rendam slaid dalam PBS selama 3 kali, 3 minit setiap kali.
3. Permeabilize dengan 0.5 peratus Triton X-100 (disediakan dalam PBS) selama 20 minit pada suhu bilik (untuk antigen yang dinyatakan pada membran sel, langkah ini diabaikan).
4. Penyekat serum: rendam slaid dalam PBS selama 3 kali selama 3 minit setiap kali, keringkan PBS dengan kertas penyerap, tambah serum kambing biasa (dengan syarat sumber antibodi sekunder adalah kambing) pada slaid, dan sekat pada suhu bilik untuk 30 min.
5. Tambah antibodi primer: Serap larutan penyekat dengan kertas penyerap, jangan basuh, tambah jumlah antibodi primer cair yang mencukupi pada setiap slaid dan masukkan ke dalam kotak basah, eramkan pada 4 darjah semalaman.
6. Tambah antibodi sekunder pendarfluor: rendamkan slaid dalam PBST selama 3 kali, 3 minit setiap kali, serap cecair yang berlebihan pada slaid dengan kertas penyerap, tambah antibodi sekunder pendarfluor yang dicairkan setitis demi setitik, eramkan pada 20-37 darjah selama 1j dalam kotak basah, rendam dalam PBST Slice 3 kali, 3 min setiap kali.
Nota: Daripada penambahan antibodi sekunder pendarfluor, semua langkah seterusnya hendaklah dilakukan di tempat yang gelap sebanyak mungkin.
7. Penyekat serum: hapuskan cecair dengan kertas penyerap, titiskan serum kambing biasa pada slaid kaca (dengan syarat sumber antibodi sekunder adalah kambing), dan sekat pada suhu bilik selama 30 minit.
8. Tambah antibodi primer: Serap larutan penyekat dengan kertas penyerap, jangan basuh, kemudian tambah antibodi primer yang dicairkan secara titisan, dan inkubasi semalaman dalam kotak lembap 4 darjah dalam gelap selepas menambah antibodi utama. (Nota: spesies antibodi primer kedua adalah berbeza daripada spesies antibodi primer pertama, seperti tetikus dan arnab)
9. Tambah antibodi sekunder pendarfluor: rendamkan slaid dalam PBST selama 3 kali, 3 minit setiap kali, serap cecair yang berlebihan pada slaid dengan kertas penyerap, tambah antibodi sekunder pendarfluor yang dicairkan setitis demi setitik, eramkan pada darjah 20-37 selama 1j dalam kotak basah, rendam dalam PBST Slice 3 kali, 3 min setiap kali. (Nota: Jika pendarfluor merah dipilih untuk pengesanan antibodi pertama, yang kedua mesti memilih warna pendarfluor yang lain)
10. Nukleus Counterstaining: DAPI ditambah titisan dan diinkubasi dalam gelap selama 5 minit, spesimen diwarnakan, dan lebihan DAPI dicuci dengan PBST 5min × 4 kali.
11. Keringkan cecair pada slaid dengan kertas penyerap, tutup slaid dengan cecair pelekap yang mengandungi pelindapkejut anti-pendarfluor, dan amati dan kumpulkan imej di bawah mikroskop pendarfluor.
