1. Pemulihan sel
Selepas sel-sel yang dipelihara telah dikeluarkan daripada nitrogen cecair, ia dicairkan dengan goncangan berterusan dalam mandi air 37 darjah. Pindahkan sel yang dicairkan ke dalam tiub emparan, tambahkan medium lengkap DMEM yang telah dipanaskan pada 37 darjah (di mana serum lembu janin adalah kira-kira 10 peratus ), tiup perlahan-lahan, emparan pada 500 g selama 2 minit, dan buang supernatan.
Tambah medium lengkap DMEM untuk mencuci dan membuang supernatan. Tambah medium lengkap DMEM, gaul perlahan-lahan dengan pipet, buat ampaian sel, inokulasi dalam cawan/kelalang petri, dan biakan dalam inkubator sel yang mengandungi 5 peratus CO2.
2. Laluan sel
Apabila ketumpatan sel mencapai 80 peratus ~ 90 peratus (hasil pramatang tidak mencukupi, sel terlalu lewat berada dalam keadaan buruk, subkultur pada nisbah 1:2 hingga 1:10 atau lebih, umumnya 1:3 hingga 1:5 penjanaan sel, iaitu daripada inokulasi sel Pada masa pengasingan dan penanaman semula, medium lengkap telah dikeluarkan dan dibasuh dua kali dengan 1X PBS.
Tambah trypsin (nota: jumlah larutan penghadaman adalah yang terbaik untuk menutup sel, dan suhu penghadaman optimum ialah 37 darjah . Perhatikan sel di bawah mikroskop: amati sel yang dicerna di bawah mikroskop terbalik, jika sitoplasma ditarik balik, sel-sel tidak lagi disambungkan bersama. Hirisan, menunjukkan bahawa sel-sel dicerna dengan betul pada masa ini), cernakannya dan letakkannya dalam inkubator sel selama kira-kira 2-3 minit.
Tambah jumlah medium lengkap DMEM yang sesuai untuk menghentikan trypsinization, pindahkan ke tiub centrifuge dan sentrifuge pada 500 g selama 2 minit, buang supernatan, tambah medium lengkap DMEM untuk mencuci, dan buang supernatan.
Tambah medium lengkap DMEM, gaul dengan pemipetan perlahan-lahan, pipet 10 mikroliter untuk pengiraan, dan kemudian teruskan kultur dalam inkubator sel yang mengandungi 5 peratus CO2 mengikut isipadu sel yang diperlukan.
3. Pengawetan sel
Apabila ketumpatan sel mencapai 80 peratus ~90 peratus , keluarkan medium lengkap dan basuh 2 kali dengan 1X PBS. Tambah trypsin untuk penghadaman dan letakkan dalam inkubator sel selama kira-kira 2-3 min. Tambah medium lengkap DMEM untuk menghentikan pencernaan trypsin, pindahkan ke tiub emparan dan emparan pada 500 g selama 2 minit, buang supernatan, tambah medium lengkap DMEM untuk mencuci, dan buang supernatan. Tambah 1ml larutan pembekuan (90 peratus serum lembu janin, 10 peratus DMSO. Secara umumnya, kandungan serum boleh dilaraskan antara 10 peratus dan 90 peratus . Menambah serum ke dalam larutan pembekuan boleh menyediakan nutrien untuk sel di satu pihak, dan boleh Sediakan bahan pelindung tidak telap semasa pengawetan sel, seperti sukrosa, albumin, dll. untuk melindungi sel dengan lebih baik), masukkannya ke dalam tiub pengawetan (terdapat isopropil alkohol dalam tiub untuk memastikan kelajuan pengurangan suhu), letakkannya dengan segera Bekukan dalam peti sejuk 4 darjah selama 30 minit, kemudian letakkan dalam peti sejuk -20 darjah selama 30 minit, dan kemudian letakkan dalam peti sejuk -80 darjah semalaman.
Letakkannya dalam nitrogen cecair pada keesokan harinya, ia boleh disimpan selama sekurang-kurangnya dua tahun, dan jika anda tidak memasukkannya ke dalam nitrogen cecair, ia boleh disimpan selama tiga bulan.
Prinsip pengawetan dan pemulihan sel ialah: pembekuan dan pencairan yang perlahan, yang lebih kondusif untuk mengekalkan daya maju sel. Cryopreservation sel tanpa sebarang agen pelindung akan membawa kepada pengeluaran kristal ais intraselular, yang akan menyebabkan kerosakan mekanikal endogen kepada sel, menyebabkan perubahan dalam tekanan osmotik persekitaran intraselular, pH, elektrolit, dan lain-lain, dan kemudian menggalakkan kematian sel.
4. Perkara yang memerlukan perhatian
(1) Prapanaskan larutan kultur: masukkan botol yang disediakan yang mengandungi larutan kultur, PBS dan trypsin ke dalam tab mandi air 37 darjah untuk dipanaskan;
(2) Gunakan 75 peratus alkohol untuk mengelap meja kerja ultra-bersih dan tangan yang telah disinari dengan sinaran ultraungu;
(3) Penempatan instrumen terpakai yang betul: memastikan ruang operasi yang mencukupi, yang bukan sahaja mudah untuk dikendalikan tetapi juga mengurangkan pencemaran;
(4) Nyalakan lampu alkohol: ambil perhatian bahawa nyalaan tidak boleh terlalu kecil;
(5) Operasi aseptik yang ketat;
(6) Pencernaan sederhana sel melekat: Masa penghadaman dipengaruhi oleh banyak faktor seperti jenis larutan penghadaman, masa penyediaan dan jumlah yang ditambahkan pada kelalang kultur. Semasa proses pencernaan, perhatian harus diberikan kepada perubahan dalam bentuk sel yang dikultur. Sebaik sahaja sitoplasma mengecut, Jika sambungan menjadi longgar, atau terdapat tanda-tanda terapung berkeping-keping, penghadaman harus ditamatkan serta-merta;
(7) Semua operasi pada sel yang dilalui hendaklah sehampir mungkin dengan nyalaan lampu alkohol. Adalah lebih baik untuk bekerja dengan hanya satu sel pada satu masa, menggunakan satu set peralatan untuk setiap sel. elakkan jangkitan silang;
(8) Mulut botol sel yang dilalui perlu disterilkan pada lampu alkohol setiap kali ia dibuka atau ditutup.
