Apabila anda baru sahaja menamatkan pengajian dan memasuki pekerjaan, anda berhadapan dengan sekumpulan kata nama yang menghadapi percubaan PCR kuantitatif masa nyata. Adakah anda keliru tentang mana untuk bermula? Apakah maksud lengkung amplifikasi, lengkung piawai, ambang, nilai CT, lengkung lebur dan garis dasar? Imej pendarfluor daripada eksperimen tersebut terlalu terang, tetapi saya nampaknya tidak dapat mengenal pasti mereka. Hari ini, kami akan membawa anda mempelajari pengetahuan dan konsep ini dalam dua bahagian: istilah teknikal dan soalan lazim.
Bahagian I Syarat Profesional
1. Keluk penguatan
Lengkung amplifikasi merujuk kepada lengkung di mana nombor kitaran ialah absis dan keamatan pendarfluor masa nyata semasa tindak balas ialah ordinat semasa PCR.
2. Garis dasar
Garis dasar merujuk kepada sedikit perubahan dalam isyarat pendarfluor semasa beberapa kitaran pertama tindak balas penguatan PCR. Tahap isyarat menunjukkan hampir kepada garis lurus, iaitu garis dasar.
3. Tetapan ambang pendarfluor
Biasanya, isyarat pendarfluor bagi 15 kitaran pertama tindak balas PCR digunakan sebagai isyarat latar belakang pendarfluor, dan ambang pendarfluor ialah 10 kali sisihan piawai bagi isyarat pendarfluor semasa 3-15 kitaran PCR dan ambang pendarfluor. ditetapkan semasa fasa eksponen penguatan PCR. Biasanya, setiap instrumen mempunyai ambang pendarfluor sebelum digunakan.
4. Nilai CT
Nilai CT mewakili bilangan kitaran yang akan berlaku untuk setiap tiub tindak balas PCR apabila isyarat pendarfluor mencapai ambang yang ditetapkan. Daripada penyelidikan, kita tahu bahawa terdapat hubungan linear antara nilai CT setiap templat dan logaritma nombor salinan permulaan templat tersebut. Semakin tinggi nombor salinan awal, semakin kecil nilai CT, dan sebaliknya. Menggunakan piawaian dengan nombor salinan permulaan yang diketahui, lengkung penentukuran boleh dibuat di mana abscissa mewakili logaritma nombor salinan permulaan, manakala ordinat mewakili nilai CT. Oleh itu, selagi nilai CT sampel yang tidak diketahui diperolehi, nombor salinan awal sampel boleh dikira daripada lengkung piawai.
mengetahui lebih lanjut
Terdapat beberapa penunjuk untuk menilai sama ada keluk amplifikasi adalah baik atau tidak:
Jawapan: Titik infleksi lengkung adalah jelas, terutamanya fasa eksponen sampel pecahan berat rendah adalah jelas, keselarian keseluruhan lengkung amplifikasi adalah sangat baik, garis dasar adalah rata, tiada fenomena meningkat, dan amplifikasi lengkung sampel kepekatan fasa eksponen tahap rendah adalah sangat baik. jelas.
B: Kecerunan fasa eksponen lengkung adalah berkadar terus dengan kecekapan amplifikasi, semakin besar cerun, semakin tinggi kecekapan amplifikasi.
C: Garis asas standard adalah rata atau sedikit menurun, tanpa aliran menaik yang jelas.
D: Keselarian lengkung penguatan bagi setiap tiub adalah baik, menunjukkan bahawa kecekapan penguatan setiap tiub tindak balas adalah serupa.
5. Lengkung lebur
Apabila produk PCR dipanaskan, apabila suhu meningkat, produk amplifikasi beruntai dua secara beransur-ansur tercerai, mengakibatkan penurunan keamatan pendarfluor. Apabila suhu tertentu dicapai, sejumlah besar produk terpisah, mengakibatkan penurunan mendadak dalam pendarfluor. Menggunakan fungsi ini bersama-sama dengan nilai TM yang berbeza untuk produk PCR yang berbeza juga berbeza dalam suhu di mana isyarat pendarfluor berkurangan dengan cepat, yang mungkin merupakan cara yang baik untuk mengenal pasti kekhususan PCR.
6. Lengkung lebur (menggunakan lengkung logaritma)
Graf puncak dibentuk oleh logaritma lengkung lebur untuk memaparkan keadaan serpihan produk dengan lebih intuitif. Memandangkan suhu lebur ialah nilai TM bagi serpihan DNA, parameter tertentu yang mempengaruhi nilai TM bagi serpihan DNA boleh ditentukan, seperti saiz serpihan, kandungan GC, dll. Secara umumnya, mengikut prinsip reka bentuk primer kami, ia biasanya dikatakan bahawa panjang produk yang dikuatkan berada dalam julat 80-300bp, dan suhu lebur hendaklah antara 80 darjah dan 90 darjah .
J: Jika terdapat hanya satu puncak utama antara 80 darjah dan 90 darjah , ini bermakna PCR masa nyata adalah sempurna.
B: Jika puncak utama muncul antara 80 darjah dan 90 darjah, dan puncak kekotoran muncul di bawah 80 darjah, primer-dimer pada asasnya dipertimbangkan. Ini adalah pilihan yang baik untuk cuba diselesaikan dengan menaikkan suhu penyepuhlindapan.
C: Jika puncak utama muncul antara 80 darjah dan 90 darjah , dan puncak mengembara muncul apabila suhu meningkat, pencemaran DNA pada asasnya dipertimbangkan. Dan DNA perlu dikeluarkan pada peringkat awal eksperimen.
7. Garis lengkung piawai
Piawaian piawai telah dicairkan kepada kepekatan yang berbeza dan digunakan sebagai templat untuk tindak balas PCR. Lengkung piawai diplot dengan logaritma nombor salinan piawai sebagai absis dan nilai CT yang diukur sebagai ordinat. Apabila mengukur sampel yang tidak diketahui, nombor salinan sampel boleh diperolehi daripada lengkung piawai berdasarkan nilai CT sampel yang tidak diketahui. Keluk piawai sangat penting untuk pengiraan mutlak.
bahagian kedua. masalah biasa
S1: Apakah perbezaan antara RT-PCR, QPCR, PCR masa nyata dan RT-PCR masa nyata?
A1: RT-PCR ialah PCR transkripsi terbalik, yang merupakan varian tindak balas rantai polimerase yang digunakan secara meluas. Dalam RT-PCR, helai RNA ditranskripsikan secara terbalik ke dalam DNA pelengkap, yang kemudiannya digunakan sebagai templat untuk PCR untuk menguatkan DNA oleh PCR.
PCR masa nyata dan QPCR adalah perkara yang sama, kedua-duanya adalah PCR kuantitatif masa nyata, yang bermaksud terdapat rakaman data masa nyata pada setiap kitaran semasa proses PCR. Dengan cara ini, bilangan templat permulaan boleh dianalisis dengan tepat.
Walaupun kedua-dua PCR masa nyata dan PCR transkripsi terbalik nampaknya disingkatkan sebagai RT-PCR, konvensyen antarabangsa ialah RT-PCR merujuk secara khusus kepada PCR transkripsi terbalik, manakala PCR masa nyata sering disingkatkan sebagai qPCR (Quantitative Real- True Real-True Real PCR ) - PCR masa).
RT-PCR (RT-QPCR) masa nyata ialah sejenis PCR transkripsi terbalik yang menggabungkan teknik kuantitatif pendarfluor: transkripsi songsang pertama daripada RNA untuk mendapatkan cDNA (RT), diikuti dengan analisis kuantitatif menggunakan PCR masa nyata (QPCR).
S2: Mengapakah panjang serpihan produk yang dikuatkan bagi PCR kuantitatif pendarfluor dikawal dalam julat 80-300bp?
A2: Panjang setiap jujukan gen adalah berbeza, sebahagian daripadanya adalah beberapa Kb dan ratusan BP. Walau bagaimanapun, apabila kami mereka bentuk buku asas, kami hanya perlu menghendaki panjang produk adalah 80-300bp, dan terlalu pendek atau terlalu panjang tidak sesuai untuk pengesanan PCR kuantitatif.
Serpihan produk terlalu pendek untuk dibezakan daripada primer-dimer. Panjang primer-dimer ialah kira-kira 30-40bp, apabila kurang daripada 80bp, sukar untuk membezakan sama ada ia adalah primer-dimer atau produk. Jika serpihan produk terlalu panjang, melebihi 300bp, ia akan dengan mudah membawa kepada kecekapan amplifikasi yang rendah, dan jumlah gen tidak dapat dikesan dengan berkesan.
Sebagai contoh, apabila anda mengira bilangan orang dalam bilik darjah, anda hanya perlu mengira bilangan mulut yang ada. Perkara yang sama berlaku apabila menguji gen. Anda hanya perlu mengesan urutan gen tertentu untuk mewakili keseluruhan jujukan. Sangat mudah untuk membuat kesilapan jika anda mengira kedua-dua mulut dan hidung, telinga dan cermin mata untuk mengira orang.
S3: Apakah panjang optimum untuk reka bentuk primer?
A3: Secara umumnya, panjang primer dalam julat 20-24bp adalah baik. Sudah tentu, kita mesti memberi perhatian kepada nilai TM primer apabila mereka bentuk buku asas, kerana ia berkaitan dengan suhu penyepuhlindapan yang optimum. Selepas banyak percubaan, telah terbukti bahawa 60 darjah adalah nilai TM yang baik. Suhu penyepuhlindapan yang rendah dengan mudah boleh membawa kepada penguatan bukan khusus, manakala suhu penyepuhlindapan yang tinggi biasanya membawa kepada kecekapan penguatan yang rendah, keluk penguatan puncak lewat dan nilai CT yang tertunda.
Soalan 4: Adakah jumlah sampel yang dikumpul mempengaruhi keputusan eksperimen?
J4: Tidak. Jelas sekali, lebih banyak sampel dikumpul, lebih banyak RNA yang diekstrak, lebih banyak cDNA, dan lebih banyak serpihan sasaran akan ada. Untuk kuantifikasi mutlak, adalah perlu untuk mengira nombor salinan serpihan sasaran, dan jumlah sampel yang dikumpul pasti akan mempengaruhi keputusan eksperimen. Sebagai contoh, pengesanan virus hepatitis C HBV dalam darah adalah untuk mengesan kandungan HBV dalam jumlah tertentu (1ml) darah.
Untuk kuantifikasi relatif yang biasa digunakan dalam penyelidikan saintifik, bilangan sampel tidak ada kaitan dengan keputusan eksperimen, kerana kuantifikasi relatif merujuk kepada perbandingan antara gen sasaran dan gen rujukan. Sila anggap mereka sebagai serpihan hulu dan hilir yang terdapat dalam helai asid nukleik yang sama. Jika saiz sampel adalah besar, kedua-dua rujukan dan gen sasaran ditingkatkan dalam perkadaran yang sama pada masa yang sama, yang tidak menjejaskan keputusan.
S5: Adakah kecekapan transkripase terbalik menjejaskan keputusan eksperimen?
A5: Sama seperti di atas. Ambil perhatian bahawa kami mahukan kecekapan RT yang lebih tinggi, tetapi kami lebih suka enzim RT agak stabil dan memperoleh hasil yang seragam. Ini akan menjadi ujian ke atas keupayaan dioptimumkan bagi suite transkripsi terbalik syarikat utama.
Soalan 6: Adakah kecekapan enzim TAQ mempengaruhi keputusan eksperimen?
A6: Kecekapan enzim TAQ agak besar. Biasanya, enzim taq permulaan panas diperlukan dan agak cekap. Untuk kit kuantitatif pendarfluor komersial, setiap pengeluar akan mengoptimumkan kecekapan keadaan terbaik mengikut produk mereka sendiri hampir 100 peratus, jika kecekapan terlalu rendah, keputusan eksperimen tidak boleh diperolehi. Untuk produk syarikat yang berbeza, ini adalah ukuran kualiti.
Soalan 7: Adakah jumlah pewarna pendarfluor mempengaruhi keputusan eksperimen?
J7: Ya, ia akan. Jika fluorokrom terlalu tepu, ia boleh menyebabkan gangguan bunyi dalam sesetengah instrumen. Jika fluorochrome tidak tepu, dan nilai pendarfluor terlalu rendah, ia akan memasuki fasa dataran tinggi lebih awal dan lengkung amplifikasi akan menjadi rata. Dalam eksperimen kuantitatif pendarfluor, nilai CT terutamanya dilihat, jadi tidak penting untuk lengkung penguatan lewat memasuki peringkat dataran tinggi, tetapi gambar tidak cukup cantik. Jika anda terpaksa memilih, mulakan dengan memilih fluorokrom yang kurang tepu sedikit. Walau bagaimanapun, apabila menggunakan produk yang sama dari syarikat yang sama, kesannya pada asasnya boleh diabaikan.
Soalan 8: Adakah penghantaran tiub PCR menjejaskan keputusan eksperimen?
A8: Ya. Walau bagaimanapun, untuk kumpulan bahan habis pakai yang sama daripada pengeluar yang sama, kesan ini boleh diabaikan. Ini adalah pilihan yang baik dan sebaik-baiknya menggunakan 96-plat perigi dengan membran kebolehtelapan tinggi untuk meminimumkan kesan penghantaran cahaya bahan habis.
S9: Adakah ralat semasa operasi menjejaskan keputusan eksperimen?
A9: Pengaruh proses operasi terutamanya dicerminkan dalam keseragaman. Kehomogenan bermakna semua komponen dalam sistem bercampur sama rata, dan sentrifugasi kilat boleh menyelesaikan masalah ini. Selain itu, bagi pemula, sebaiknya laraskan sistem PCR menjadi lebih daripada 20 inci, dan sistem yang terlalu kecil lebih terdedah kepada ralat. Jika suhu penyepuhlindapan dioptimumkan dengan betul, kesan kepekatan primer pada CT diminimumkan. Dan anda akan tahu bahawa beberapa ralat operasi (seperti kepekatan primer) boleh dielakkan dengan mengoptimumkan suhu penyepuhlindapan.
ringkaskan
Di atas ialah beberapa soalan dan soalan yang sering dihadapi oleh orang baru semasa percubaan, kami berharap soalan ini dapat membantu anda menyelesaikan sedikit kekeliruan. Percubaan ialah proses menjana huru-hara dan menyelesaikan masalah, semoga anda mendapat sesuatu daripadanya. Terima kasih kerana membaca dan kita akan berjumpa lagi pada masa akan datang!